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Arquitectura e funcionalidade da cromatina

Autor

Veterinaria.org

Fecha de publicación

25/12/2011

Resumen

 A cromatina é uma combinação de DNA, histonas e outras proteínas que constituem os cromosssomas. Alterações ao nível da cromatina podem ocorrer em virtude de modificações ao nível do DNA e ao nível das histonas. 

Artículo

 

Por Dias Correia; J. H. R. : CIISA, Departamento de Morfologia e Função, Faculdade de Medicina Veterinária da UTL, Avenida da Universidade Técnica, Pólo Universitário, Alto da Ajuda, 1300-477,  Lisboa,  Portugal jhrdcorreia@fmv.utl.pt  | Dias Correia, A. A.: Professor jubilado de Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica, pólo universitário, Alto da Ajuda , 1300-477,  Lisboa,  Portugal.

Resumo

A cromatina é uma combinação de DNA, histonas e outras proteínas que constituem os cromosssomas. Alterações ao nível da cromatina podem ocorrer em virtude de modificações ao nível do DNA e ao nível das histonas. A cromatina existe em formas condensadas e não condensadas, com diversas ordens de condensação e com uma topografia própria. A estrutura da cromatina é regulada por modificações especificas post tradução das histonas, existindo ainda histonas clássicas e histonas variantes. Complexos modificadores das histonas e da cromatina e complexos remodeladores da cromatina regulam a estrutura e funcionamento da croma tina. Nas histonas clássicas hà diversos tipos de histonas com sequências sensivelmente idênticas, existindo no entanto com outros sub-tipos. A montagem da cromatina é um processo muito complexo consoante as etapas em que decorre com diversos factores intervenientes, inclusive com a introdução de variantes das histonas. Ao nível do DNA observam-se diversas geometrias que lhe imprimem características dinâmicas e funcionais próprias, com conformações alternativas, embora existam aspectos básicos comuns na regulação da actividade dos genes eucariotas codificadores de proteínas, com intrões, exões, locais de inicio, promotores, enhancers, silenciadores e genes adjacentes, sendo os factores de transcrição classificados em função das suas características reguladoras da transcrição

Palavras chave: Cromatina, histona H1, H2A, H2B, H3, H4, H5 H3.3, nucleossomas, octâmeros, ilhotas CpG, DNA A, B e Z ,transcrição, factores de transcrição 

Summary 

The chromatin is a combination of DNA, histones and other kinds of proteins. It forms the chromosomes. Changes on chromatin can take place by modifications of its DNA and its histones. The chromatin occurs in condensend and non-condensed conditions (with a range of orders of condensation) and it shows a specific topography. The structure of the chromatin has been regulated by specific post-translational changes of the histones, and there are classic histones and variable histones. The structure and function of the chromatin have been regulated by histones and chromatin modifying complexes, and by remodeling complexes of the chromatin. In classic histones there are included a range of different types of histones with sequences of amino acids close to each other. The assembly of the chromatin has been a complex process following several steps controlled by a variety of intervening factors, including variable histones. In DNA a wide range of geometrical forms are presented which confer DNA specific dynamic and functional properties. Several factors regulate the function of the genes from eucariotic cells including codifying proteins, introns, exons, initiation sites, promoters, enhancers, silence genes, and adjacent genes. The transcription factors have been classified according to their transcriptional regulating features. 

Keywords: chromatin; CpG islands; A-DNA; B-DNA; Z-DNA; histones H1; histones H2A; histones H2B; histones H3; histones H4; histones H5; histones H3.3; nucleossomes; octamer; transcription; transcription factors. 

-Algumas caracteristicas da Cromatina. Eucromatina e Heterocromatina

 A cromatina é uma combinação de DNA, histonas e outras proteínas, que constituem os cromossomas.

Na estrutura básica da organização da cromatina o DNA “enrola-se” em redor das histonas formando os nucleossomas, enquanto conjuntos de nucleossomas na sua forma mais compacta formam fibras de cromatina condensada de cerca de 30 nm.

Alterações na estrutura da cromatina podem ocorrer em virtude de modificações das proteínas das histonas e outras modificações como veremos adiante. 

Recorda-se que a densidade da cromatina varia ao longo do núcleo celular (vide na figura 1 o interior do nucleo N). Assim ocorrem regiões densas de cromatina, chamadas heterocromatina e regiões de menor densidade da cromatina chamadas eucromatina.

A heterocromatina encontra-se nas partes dos cromossomas sem genes codificadores de proteínas ou com poucos genes, como sucede nos centromeros e telomeros, revelando-se densamente montada ou organizada muito enriquecida em transposões e outro DNA impropriamente designado “junk ou lixo” sendo replicada tardiamente na fase S do ciclo celular, mostrando reduzido “ crossing-over” durante a meiose.

Os genes eventualmente presentes na heterocromatina encontram-se em geral inactivos portanto sem serem transcritos e revelam algumas características curiosas , ao nível do DNA e ao nível das histonas:

-Ao nível do DNA:

     metilação aumentada das citosinas das ilhotas de CpG do DNA:

-Ao nível das histonas:

     acetilação diminuta das histonas, mas metilação aumentada da lisina 9 da histona 3 (K9H3) o que favorece a interacção com a proteína HP1 (heterochromatin protein 1) que bloqueia o acesso a factores de transcrição para a transcrição dos genes.

A eucromatina encontra-se nas partes dos cromossomas que contêm diversos genes, estando organizada em ansas de fibras de 30nm e separada da heterocromatina adjacente por isoladores.(Vide adiante)

Aquelas ansas das fibras situam-se próximas dos complexos que formam os poros nucleares o que facilita a saída dos transcriptos para o citosol (vide esquema na figura  1 e 2

    

Os genes na eucromatina em actividade revelam uma metilação diminuída das citosinas das ilhotas CpG do DNA, uma acetilação aumentada das histonas e uma metilação diminuída da lisina 9 da histona 3 (K9H3) como veremos adiante.

1 -Algumas características ao nível das histonas.

1.1.-DNA, histonas e outras proteínas, nucleossomas e cromossomas.

(A parte inicial deste sub-capitulo foi transcrita da obra “ Elementos de Biologia Molecular Animal” de Correia e Correia)

Os cromossomas são estruturas celulares para armazenagem e transmissão da informação genética.

Os cromossomas das células eucariotas são complexos de DNA (10-30%), RNA (3-15%) e proteínas (40-75%).

As proteínas cromossomais podem ser divididas em duas classes: as histonas básicas, e as proteínas não-histonas, mais acídicas. 

Há seis classes de histonas, enquanto que as proteínas não-histonas dão centenas de bandas após separação umas das outras por electroforese em gel. As histonas combinam-se com o DNA formando complexos fibrilares.

As proteínas não-histonas (englobam também as polimerases) são provavelmente implicadas na regulação da transcrição.  

Um cromossoma duma célula eucariota contem uma molécula simples e linear de DNA em hélice dupla, encontrando-se este profundamente ligado às histonas que constituem cerca de metade da massa dos cromossomas. Os cinco tipos de histonas, (não consideramos o 6º tipo: as H5), H1, H2A, H2B, H3 e H4, todas elas contêm um alto teor de ácidos aminados básicos com as cadeias laterais dos ácidos aminados a estarem carregadas electricamente com sinal positivo.

Cada tipo de histona pode existir em diversas formas em virtude das modificações (após a tradução) de certas cadeias laterais dos seus resíduos de ácidos aminados.

(Entende-se por nucleossoma as pequenas unidades estruturais de cromatina que consistem de um conjunto de proteínas histonas ( octâmeros) à volta do qual se enrola um pedaço de DNA com cerca de 146bp).

A maioria do DNA está enrolado por fora do âmago das histonas, sendo o DNA que se encontra entre os nucleossomas (o DNA linker ou espaçador) aquele que contribui para a flexibilidade da fibra de cromatina. Uma fibra de cromatina é pois uma cadeia de nucleossomas unidos de uma forma flexível. 

Os cromossomas das células eucariotas formam estruturas complexas antes da divisão celular (mitose ou meiose) e, nesta altura, cada cromossoma consiste de duas metades longitudinalmente idênticas: os cromatídeos, unidos num ponto denominado centrómero.

Também sequências especializadas de DNA, os telómeros, encontram-se nas extremidades dos cromossomas lineares.

Os centrómeros (que são responsáveis pelo movimento dos cromossomas para as células filhas) são o local onde os cromossomas se constringem durante a metafase e em que se separam os braços curtos dos compridos do cromossoma.

Tanto os centromeros como os telomeros contêm conjuntos curtos de sequências de DNA repetidos em tandem .

Os telomeros são compostos por um grande número de curtas sequências repetidas e que são conservadas, independentemente da replicação, pela enzima telomerase.

No núcleo o DNA está pois“empacotado” num complexo nucleoproteico conhecido por cromatina, a qual é grosseiramente constituída por duas partes de proteínas para uma de DNA, sendo ainda a proporção histonas / DNA de um para um.

Por sua vez, a cromatina é um material corável do núcleo em interfase, consistindo de DNA, RNA e proteínas, dispersas um tanto ao acaso no núcleo das células eucariotas.

A maior parte da cromatina num núcleo em interfase encontra-se presente como filamentos de 30 nm de diâmetro, mais do que na forma de fibras distendidas de 10nm de diâmetro (colar de pérolas)

O DNA cromossomal nesta interfase está intacto, ou seja, em parte desenrolado ou relaxado.

Antes da divisão celular a cromatina condensa-se em corpos densos ( cromossomas ) que podem ser corados intensamente.Diga-se desde já que é a estrutura da cromatina que regula a expressão dos genes.

Um gene inactivo existe, , como uma estrutura de cromatina reprimida (quanto à transcrição) e que pode encontrar-se “dobrada”, ou compactada, em ordem a torná-la inacessível aos factores de transcrição.

No entanto, no estado activo, ou desreprimido, a estrutura da cromatina deve apresentar-se descondensada, ou “ desdobrada”, e a estrutura dos nucleossomas pode, por sua vez, ser alterada sendo que provavelmente as histonas H1, mais do que quaisquer outras histonas, podem ter sido removidas.

Uma importante função dos factores que se ligam ao promotor e ao “enhancer” no DNA ( vide adiante) consiste em remover a repressão mediada pela cromatina,da transcrição o que por vezes se designa por anti-repressão.

O DNA na cromatina está pois organizado em unidades repetidas regularmente, os nucleossomas, que contêm sucessivos segmentos da hélice dupla de DNA com ± 200 pares de bases de comprimento associados com um octâmero de quatro proteínas histonas, H3, H4, H2A e H2B, estando o DNA enrolado cerca de duas vezes á volta deste octâmero. No ponto de entrada e de saída o DNA está unido a outra histona: a H1.(formando o cromatossoma). Esta unidade estrutural repete-se ao longo de todo o DNA formando um filamento que pode enrolar-se numa estrutura helicoidal, ou “solenóide”, para formar um segundo nível de enrolamento (vide figuras adiante).

Durante a interfase celular a maioria da cromatina não se encontra condensada, sendo neste estado feita uma distinção morfológica entre a heterocromatina firmemente “packed” (empacotada) e a eucromatina, muito menos “packed”(empacotada), sendo esta última transcrita activamente. As proteínas histonas, ricas em ácidos aminados básicos com cadeias laterais ionizadas positivamente, contactam com os grupos fosfatos ionizados negativamente do DNA. Alguns destes ácidos aminados básicos das histonas têm as cadeias laterais modificadas pela adição, após a tradução, de grupos metilo, acetilo ou fosfato ou outros, neutralizando a carga positiva da cadeia lateral, ou convertendo-a numa carga negativa.

A sequência em ácidos aminados das quatro histonas (H2A, H2B, H3 e H4) são muito semelhantes entre as diversas espécies animais.  

A sequência em ácidos aminados da H1 varia mais de organismo para organismo, sendo até em certos tecidos substituída esta H1 por histonas especiais, como por exemplo a H5.

A cromatina existe pois em formas condensadas e em formas não condensadas ou distendidas, como se fosse um colar de pérolas (proteínas histonas separadas umas das outras mas unidas por um filamento único (DNA)) (vide figura seguinte).

Os nucleossomas têm cerca de 10nm de diâmetro, podendo assumir também formas mais condensadas de vários nucleossomas, constituindo neste caso fibras de 30nm de diâmetro.

O DNA que envolve as histonas é muito menos sensível à digestão por enzimas do que o DNA que se encontra ligando os sucessivos nucleossomas entre si.

Os nucleossomas contêm cerca de 146 pares de bases de DNA enquanto o DNA que liga dois nucleossomas sucessivos (DNA espaçador) parece apresentar cerca de 14 a 54 pares de bases com o DNA de 146 pares de bases enrolado cerca de duas vezes à volta da superfície do octâmero.

Há proteínas acídicas, sem serem histonas, associadas, no entanto, com as histonas e que não estão “organizadas” nos nucleossomas, embora estejam envolvidas na organização e estrutura dos cromossomas constituindo a armação (scaffold) dos cromossomas (vide esquemas seguintes). Estas proteínas não-histonas formam pois um scaffold (esqueleto ou armação) estrutural para a formação de longas ansas de DNA nos cromossomas. 

 

A cromatina contem pequenas quantidades de outras proteínas que se ligam ao DNA sem serem histonas ou proteínas do scaffold como, por exemplo, factores de transcrição e outros tipos de proteínas.



Na sua forma condensada a cromatina apresenta uma estrutura de tipo solenóide com fibras de cerca de 30nm de diâmetro e com uma histona H1 associada a cada nucleossoma.



Portanto duas formas de cromatina podem existir: a forma condensada e a não condensada ou distendida, dentro do mesmo cromossoma.

As regiões cromossomais que não estão sendo transcritas encontram-se predominantemente na forma condensada, enquanto as distendidas estão provavelmente sendo transcritas.

A cromatina, organizada em grandes unidades de centenas a milhares de kilobases de comprimento, constituindo os cromossomas, encontra-se em número e forma que são específicos das espécies de seres vivos (vide quadro seguinte).



Na maioria dos organismos o número de cromossomas não varia e cada cromossoma contem uma molécula de DNA linear.

Topografia dos cromossomas.

Em células diplóides quiescentes, as distancias entre cromossomas interhomólogos e os mapas da posição dos cromossomas homólogos revela uma topologia preferencial e não ao acaso para os cromossomas 7, 8, 16 (em células humanas) enquanto o cromossoma X tem uma distribuição mais ao acaso. ( Nagele et al.,1999).

Parece haver uma topologia ordenada dos cromosssomas na interfase, em células quiescentes e tambem nas células de animais e plantas, com pelo menos alguns cromossomas homólogos a revelarem uma preferência para determinada posição no núcleo que pode corresponder à ordem no espaço dos cromossomas nas rosettes das células mitóticas ( Nagele et al., 1999).

Também o perfil de distribuição dos centromeros e telomeros parece variar consoante o tipo de célula e a sua fase no ciclo celular, podendo ser influenciado pelo estado de diferenciação da célula ( Vourch’ h et al. 1993 cit. In Nagele et al., 1999).

Identicamente os genes activos não se encontram distribuídos ao acaso no núcleo, mas concentrando-se na periferia do núcleo e junto aos poros deste como referimos anteriormente.

Estudada a ordem, ou melhor, os territórios ocupados pelos cromossomas em celulas HeLa durante a mitose e no início da fase G1 ( Walter et al., 2003) parece poder-se concluir que estes arranjos dos territórios são mantidos estavelmente do meio da etapa G1 até á posterior G2/início da profase, enquanto ocorrem modificações nesses territórios de um ciclo celular para o ciclo celular seguinte ( Walter et al.,2003).

Quanto à topologia dos cromossomas em interfase, nos mamíferos ( Haap e Schmid, 1991) parece  não haver duvidas da existência de uma organização altamente ordenada nos núcleos celulares. Contudo parece não existir um arranjo dos cromossomas que seja universal para todas as células.

No entanto os cromossomas são arranjados no interior dos núcleos de acordo com os seguintes factores: ( Haaf e Schmid, 1991)

1)- os cromossomas individuais permanecem em regiões ou domínios separados, através da interfase, impedindo uma mistura da eucromatina descondensada

2)- as regiões do cromossoma que contêm heterocromatina constitutiva associam-se em cromocentros maiores.

3)- na maioria dos tipos celulares não são observadas associações directas , na interfase, entre os domínios de cromossomas homólogos. Noutros, regiões heterocromatinicas homólogas tendem a ser emparelhadas

4)- na interfase, os cromossomas não se encontram a flutuar no nucleoplasma mas sim associados em diversos graus com a membrana nuclear e outros componentes da matriz do núcleo (esqueleto fibroso intranuclear)

5)- as posições dos centrómeros não se encontram ao acaso e são carcterísticas de cada célula

6)- as pontas dos telómeros tendem a associar-se.

O núcleo celular é pois estruturalmente e funcionalmente compartimentado como temos vindo a referir e a regulação epigenética da expressão de um gene pode envolver o reposicionamento do locus no núcleo através de mudanças em larga escala da estrutura da cromatina ( vanDriel et al 2003).

Como é sabido a activação da transcrição está correlacionada com a descondensação da cromatina desenrolando-se a fibra cromossomal aumentando a distância entre os nucleossomas e emitindo ansas para fora do território do “corpo” do cromossoma, possivelmente com a libertação de algumas proteínas.

Por outro lado, a condensação da cromatina é forçada por modificações específicas das histonas ( por ex: por metilação da lisina 9 da histona H3) e subsequente ligação de proteínas como as HP1 ( Turner 2002 cit. In vanDriell,2003). Há contudo outras modificações das proteínas ligadas à cromatina e das histonas que têm um efeito oposto orginando uma estrutura cromatinica mais aberta, como sucede quando da acetilação das histonas e da metilação da H3 na lisina 4 ( Memedula e Belmont. 2003, cit. In vanDriell,2003).

No entanto, ocorre um arranjo espacial dos territórios dos cromossomas nos núcleos eucariotas, os cromossomas densos em genes residem na maioria das vezes no centro do núcleo, enquanto os cromossomas pobres em genes residem mais frequentemente na periferia do núcleo ( Cremer et al 2001), com uma distribuição global dita radial. Em fibroblastos humanos senescentes e quiescentes os cromossomas pobres em genes movem-se da periferia do núcleo para uma posição mais interior e alteram a sua interacção com subestruturas do núcleo. Após reentrada no ciclo celular estes cromossomas movem-se novamente para a periferia do núcleo.

A elucidação da organização espacial dos cromossomas nos núcleos das células em interfase é assunto em debate hà muitas dezenas de anos. Parecem existir provas evidentes ( Cornforth et al., 2002) de que cada cromossoma ocupa predominantemente o seu próprio território durante a interfase celular ( Cremer e Cremer, 2001 cit . in Cornforth, 2002).

Como já referimos atrás os domínios de cromatina ricos em genes ou pobres em genes ocupam diferentes posições no núcleo embora isto varie consoante o tipo de célula.

Embora existam claramente associações de cromossomas com cromossomas, na generalidade parece predominar uma distribuição dentro do espaço nuclear um tanto ao acaso ( Cornforth et al., 2002).

Resumindo ( Ehrenhofer-Murray, 2004) o que temos vindo a referir anteriormente a cromatina é a forma básica da organização do DNA nas células eucariotas, sendo o nucleossoma a sua unidade básica constituinte, constituída por um conjunto octâmero de histonas que consiste de duas unidade de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 H4 em redor das quais se encontram 146 pares de bases do DNA, Estes conjuntos nucleossomais ao longo do DNA estão dobrados em fibras de 30 nm com a incorporação de uma histona de ligação entre eles e que é a H1.

Alem destas histonas clássicas, existem histonas variantes relacionadas estruturalmente com as histonas anteriores mas que são funcionalmente distintas.

A cromatina é geralmente inacessível ( heterocromatina) a moléculas exteriores e esta condição é ultrapassada através de factores reguladores.

Nestes factores que regulam o acesso à cromatina há que considerar duas actividades enzimáticas principais:

a) os complexos modificadores das histonas da cromatina e 

b)  os complexos remodeladores da cromatina que desenvolveremos mais adiante e apresentando desde já um resumo introdutório desta matéria. 

a) Complexos modificadores das histonas

Por modificação entende-se aqui modificações ocorridas nas histonas após a sua tradução podendo ser acetilações, metilações, fosfatações, ubiquitinações , sumoilações e ADP-ribosilações.

A maioria destas modificações ocorre nas N-extremidades das histonas com excepção da ubiquitinação que ocorre na extremidade C das H2A e H2B, estando recentemente assinaladas ( Zhang et al. cit. In Ehrenhofer-Murray, 2004) novas modificações post tradução na região âmago central das histonas.

As acetiltransferases das histonas (HATs) melhor conhecidas são as que acetilam as extremidades amino-terminais das histonas, e também os resíduos de lisina podem ser acetilados na posição e-NH3+ da cadeia lateral deste ácido aminado. Estas HAT são agrupadas em cinco famílias e elas funcionam em grandes complexos de proteinas m?ltiplas tendo algumas semelhanças na sua composição em subunidades. A acetilação das histonas é um processo reversivel pelas HDACs ( histonas desacetilases).

Em contraste com as acetilações, as metilações desencadeadas por histonas metiltransferases ( HMTs) podem ser quimicamente irreversiveis pois não são conhecidas histonas desmetilases, sendo portanto as metilações ocorridas apenas revertidas pela diluição molecular ocorrida durante a replicação ou por troca na cromatina ou por cisão proteolítica da porção proteica da proteina possuidora desse grupo metilo.

Ainda no aspecto comparativo a acetilação neutraliza a carga positiva do grupo e-NH3+ o que não sucede com a metilação.

A lisina no seu grupo e-NH3+ pode ser mono, di ou trimetilada ( Wade e Kikyo, 2002)        



As outras modificações que podem ocorrer nas histonas são a ubiquitinação, a metilação da arginina e a fosfatação das cadeias laterais das serinas e treoninas. 

Todas estas modificações das histonas podem afectar a sua estrutura e alterar a sua superfície de interacção com outras moléculas alterando assim o “código “ das histonas. Por exemplo a metilação da H3K4 está normalmente associada com a activação de genes (Santos-Rosa et al cit in Ehrenhofer-Murray,2004) enquanto a metilação H3K9 leva à repressão e formação de heterocromatina ( Bannister e tal; Lacher et al cit in Ehrenhofer-Murray,2004). 

A acetilação das histonas geralmente leva à activação de genes. 

Está assinalado em embriões de rato nas suas fases iniciais ( Sarmento et al.2004) que a metilação da lisina 9 e 4 na histona H4 e H3 respectivamnete, e a fosfatação da serina 1 na histona H4 e H2A não muda durante a transição do oocito para o embrião. 

Pelo contrário ,a hiperacetilação da histona H4 e a metilação da arginina 17 e 3 na histona H3 e H4 respectivamnete, são reduzidas naquela transição, especificamente durante a metáfase. 

Parece pois que o citoplasma do oocito e da fase inicial do embrião deve conter actividades de desacetilases e desmetilases. 

As reprogramações ocorridas no embrião nas suas fases iniciais e que são acompanhadas de modificações covalentes das histonas, podem ser estas modificações classificadas em duas categotias distintas ( Sarmento et al. 2004). Uma que contem marcas epigenéticas estáveis com a metilação da lisina 9 da histona H3 ( Me-Lys9-) H3, a metilação da lisina 4 da histona H3 (Me-Lys4-H3) e a fosfatação da serina 1 da histona H4/H2A (Ph-Ser1-H4/H2A). 

A outra categoria corresponde a marcações reversíveis tais como a hiperacetilação da histona H4, a metilação da arginina 17 da histona H3 (Me-Arg17-H3) e a metilação da arginina 3 da histona H4 (Me-Arg3-H4). 

b)  Complexos remodeladores das histonas ou da cromatina

Estes complexos em geral modificam a actividade das histonas mas não afectam a estrutura bioquímica dos nucleosssomas utilizando no entanto a energia libertada pela hidrólise do ATP para aliviar os contactos DNA- histonas e facilitar o movimento dos nucleossomas, podendo estas acções serem mais permissivas ou mais inibitórias à actuação de outros complexos factores. 

1.2- Características mais salientes ao nível das Histonas e nucleossomas

Como temos vindo a referir o DNA nas  células eucariotas não se encontra livre isolado ou nú mas sim firmemente ligado com pequenas proteínas básicas as histonas , constituindo as fibras cromatinicas.

A cromatina consiste como já referimos de proteínas que servem como uma organização estrutural para o DNA, ligando este DNA em estruturas mais ordenadas e acabando por formar os próprios cromosssomas.Em baixo faz-se um diagrama esquemático de uma região de cromatina contendo um nucleossoma e um cromatossoma. A fibra de cromatina é feita de unidades que se repetem, os nucleossomas, cada um destes nucleossomas consistindo de DNA “core” com 146 bp enrolado por fora de um “core”  (âmago) de duas de cada uma das hidstonas “core” H2A, H2B, H3 e H4. Os nucleossomas sucessivos na fibra de cromatina estão ligados entre si por DNA “linker” que contribui para a flexibilidade da fibra de cromatina ,  ou seja, a cadeia de nucleossomas.

Recorda-se que hà cinco tipos de histonas, podendo cada tipo de histona existir com sub-tipos e variantes e com variadas formas devido a modificações covalentes post traducção que podem ocorrer sobre as cadeias laterais dos resíduos de ácidos aminados ( A.A.) que as compõem.



As sequências de ácidos aminados nas H3 e H4 são sensivelmente as mesmas nas plantas e animais. Por exemplo as H4 de ervilhas e timo de vitela apenas diferem em dois locais dos 120 resíduos e as H3 nestas mesmas espécies apenas diferem em  quatro.

As histonas linker H1 têm um papel chave servindo como uma ponte entre nucleossomas adjacentes (Figura 7).



O tetrâmero formado por duas histonas H3 e duas H4 ocupa o centro do nucleossoma sendo este tetrâmero flanqueado de cada lado por um dímero de H2A-H2B. Os contactos DNA-histonas são confinados à superfície interior das superhélices de DNA. A H1 situa-se fora do nucleossoma onde interactua com o DNA linker e subunidades H2A do core do nucleossoma. 

Existe portanto por cada cromatossoma um nucleossoma , um H1 linker e duas de cada uma das histonas core. 

A H1 é fosfatada logo antes da mitose e desfosfatada após a mitose, o que parece indicar que regula a capacidade de se formar DNA compacto. È também a H1 responsável pela condensação dos nucleossomas em fibras de 30 nm. 

Cada molécula de H1, alem de interactuar com o DNA como veremos adiante, liga-se através da sua porção globular central a um único local do nucleossoma, enquanto as suas estremidades N-terminal e C-terminal se estendem para contactos com outros locais nas histonas core de nucleossomas adjacentes. (vide figura 8 seguinte).



Como já referimos cada classe de histonas excepto as H4 consiste de vários subtipos que são codificados por genes diferentes ( Makalowska e tal.,1994).

Nos mamíferos estes genes podem ser divididos quanto á sua expressão em três grupos principais.  

  • 1º- genes de histonas para a replicação, cuja expressão se restringe á etapa S do ciclo celular.
  • 2º- genes de histonas independentes da replicação que codificam as chamadas histonas de substituição, expressos  a um nível baixo mas constante, através do ciclo celular e em células diferenciadas não em divisão. Estes genes das histonas independentes da replicação consistem de subclasses H3A e H3.3B e distinguem-se das outras histonas por possuírem na estrutura dos genes  três exões.
  • 3º- genes codificando isotipos específicos dos tecidos como por exemplo as H1T e H3T exclusivamente expressas nos testículos.
Os genes para variantes de substituição apresentam localizações solitárias dentro do genoma, alguns são interrompidos por introns, enquanto os outros genes das histonas não têm introns e são orgaizados em grupos ( clusters).

No quadro seguinte referem-se os locii de genes de histonas caracterizados em seres humanos. ( Makalowska e tal.. 1999).

 

As proteínas histonas âmago ou “core”(H2A, H2B, H3 e H4) têm um grau de conservação maior do que as proteinas histonas “linker”H1 e H5. As proteínas linker só exibem uma maior conservação ao nível da sua região globular central.

A histona H5 é uma histona linker encontrada primariamente nas espécies aviárias.

Há, no entanto, uma grande variedade de proteínas histona-like semelhantes ás histonas que podem ser organizadas nas estruturas nucleossomais ( Wolfe, A. P., 2001). Neste contexto variantes das histonas core e das histonas linker, proteínas com “histona-folder” (dobras das histonas) e proteínas das famílias “Winged-helix” (hélices aladas) podem todas contribuir para a diferenciação local de domínios funcionais nos cromossomas.

As histonas core H3 e H4 não são permutadas para fora da cromatina , fora da fase S do ciclo celular.

Já as histonas core H2A e H2B são permutadas para fora da cromatina mas sobretudo durante a transcrição.

Este conjunto de circunstancias confere uma certa estabilidade aos nucleossomas através do ciclo celular.

Como já referimos é conhecido que o DNA ao nível dos nucleossomas tem um lado ou superfície ocludida sob a superfície das histonas mas o outro lado está exposto á interacção com outras moléculas sendo pois acessível a diversas outras proteínas reguladoras.

Estudos de cristalografia por raios X ( Baxevanis e tal., 1995) confirmaram que o octâmero de histonas core é um conjunto proteico tripartido composto de um tetrâmero central (H3-H4)2 flanqueado por 2 dímeros H2A-H2B, tendo este octâmero uma forma cilíndrica, sendo a dobragem ou enrolamento das 8 cadeias polipeptídicas condicionado por um motivo proteico da sua estrutura, a histona-fold.

Esta característica estrutural da histona fold corresponde a um motivo hélice-strand- hélice distendido, composto por uma curta hélice alfa ( cerca de10 resíduos de ácidos aminados) seguida por um segmento em ansa (loop)/beta strand, uma longa hélice alfa (cerca de 27 residuos), um segundo segmento em ansa (loop)/beta strand, e outro curto alfa.helice (cerca de 10 resíduos). A associação cabeça com cauda das duas histona-fold, forma os fundamentais heterodímeros de histonas, o primeiro bloco de construção para o octamero de histonas core.

Estão identificadas numerosas proteínas, inclusive factores de transcrição e recombinação, que se ligam ao DNA, que possuem na sua estrutura estas histona folder.

No complexo de transcrição TFIID existem subunidades que contêm também esta histona fold.

Num modelo proposto ( Workman e Abmayr, 2004) para explicar como as vias de montagem dos nucleossomas podem contribuir, durante a transcrição, para a substituição de histonas canónicas por histonas variantes atende-se ás seguintes etapas. 

  1. Durante a primeira ronda de transcrição os complexos modificadores das histonas ( contendo por exemplo HAT-enzimas acetiltransferases para histonas- e HMT-enzimas metiltransferases para histonas) associados com factores de transcrição ligados ao promotor e RNA polimerase II modificam os nucleossomas que tinham sido organizados durante a fase S do ciclo celular.
  2. Durante a transcrição deslocam-se alguns nucleossomas no corpo do gene e estes nucleossomas deslocados são substituídos por outros novos contendo variantes de histonas ( por ex: H3.3) de substituição, sendo isto feito por um complexo de organizados do nucleossoma independente da replicação (RI) e que pode estar associado com a RNA polimerase II.
  3. Os complexos modificadores das histonas associados com o complexo de organizados do nucleossoma podem colocar as histonas modificadas relacionadas com a transcrição antes ou depois da sua assemblagem nos nucleossomas.
  4. Depois de várias rondas de transcriçãp as histonas substituintes acumulam-se no gene e tornam-se a forma principal das histonas modificadas.
Há mais de 20 anos que Urban e Zweidler (1983)  tinham assinalado em frangos em desenvolvimento , mudanças nas histonas core ( H2A, H2B e H3) dos nucleossomas por variantes de algumas histonas tendo verificado que a intensa troca de H3 em tecidos adultos não em divisão era sobretudo devida à incorporação nos nucleossomas da variante H3.3 independentemente da replicação. 

Pouco depois em 1987 Pina e Suau  referiam que a substituição de histonas H2A e H3 por variantes poderiam estar envolvidas na diferenciação estrutural e funcional da cromatina em neurónios corticais do cérebro de ratos adultos. Assinalaram neste mesmo trabalho uma acumulação de H2A.2, H2, X e H3.3 e uma diminuição de H2.A.1, H3.1 e H3.2. 

A histona variante H3.3 é pois depositada na cromatina por uma via de organização do nucleossoma independente da replicação do DNA. ( Workman e Abmayr,2004).

A H3.3 parece conter bastantes modificações associadas com a transcrição (por ex: acetilação de certas lisinas e metilação na lisina 4).

Durante a transcrição os nucleossomas são pois substituídos parecendo que durante o alongamento pela RNA polimerase os nucleossomas seriam parcialmente ou completamente deslocados tornando-se necessário depois a sua reorganização à frente da polimerase para manter a especificidade transcricional

Histona linker H1 e posição e orientação do domínio globular da histona linker H5 sobre o nucleossoma ( Z hou e tal., 1998).

A histona linker H1 e a sua variante H5 dos eritrocitos aviários  facilitam a dobragem da fibra de cromatina para uma ordem superior com 300 Aº, cuja unidade fundamental é o cromatossoma ou partícula de cromatina que contem as histonas core, uma molécula de histona linker e 168 bp. As histonas H1 promovem pois a organização de filamentos de polinucleossomas em fibras de cromatina

As histonas linker como já referimos possuem uma região globular central (com 74 àcidos aminados) e duas caudas terminais, a N- (com 34 àcidos aminados) e a C- (com 110 Ácidos aminados). ( Vide figura  9 seguinte).

A região ou domínio globular central consiste de um feixe de três hélices I a III com uma porção C-terminal em gancho de cabelo ß. A região N-terminal não possui estrutura regular mas a região C-terminal pode encontrar-se dobrada numa estrutura mais ordenada ou desdobrada.

Tem sido sugerido que a hélice III deste domínio globular se ligaria numa face com a “major groove” do DNA com a estrutura ß em gancho de cabelo a estender-se sobre um “minor grove” adjacente do DNA. A fase oposta deste dominio globular possuiria uma estrutura secundária para ligação ao DNA pior definida. No entanto ambos os locais de ligação com o DNA sâo necessarios para a formação dos cromatossoma e para ligação das duas moleculas de DNA duplex.

A cauda C-terminal das histonas H1 revelou a presença de uma dobra “HMG-box like”.

Nesta cauda C-terminal das H1 existe um segmento de 34 ácidos aminados (Srinivas e tal.,2002) que engloba três motivos S/TPKK dentro deste domínio e que é responsável pelas propriedades de condensação das H1 do DNA:

Estes motivos tem uma posição naquela estrutura que corresponde exactamente aos segmentos para ligação com o DNA das proteínas que contêm caixas HMG.

Esta região C-terminal é crucial para a condensação do DNA e para a dobragem da cromatina para produzir fibras de cromatina de 30 nm. (Srinivas e tal., 2002).

As dobras ou caixas HMG existem nas nucleoproteínas e em diversas outras proteinas que regulam diversas funções celulares tais como interações com o DNA (162-B-4-8) 



Dobra da caixa HMG ( high mobility group) no domínio C-terminal da histona H1 e seu papel na condensação do DNA (Srinivas e tal 2002;2003)

Organização dos domínios da histona H1.

No domínio C-terminal as três repetições S/TPKK dentro do domínio C-terminal são o 145 a 148, e o 153 a 156 e o 171 a 174 (nº do resíduos de ácidos aminados).

Os motivos S/TPKK nas H1 variam um tanto consoante as espécies animais ( é o caso dos suínos).

No domínio globular os resíduos Lys 69 , Arg 73 e Lys 85 encontram-se no local primário para interacção com o DNA na major Groove e a Lys 40 e Arg 42 situam-se no local de interacção secundaria com o DNA no minor Groove. A Lys 85 interactua fortemente com o fosfato do DNA

1.3 Montagem da cromatina sua organização e factores intervenientes( Ahmad e Henikoff, 2002)

A organização da cromatina começa com a deposição do tetramero de histonas H3-H4 sobre o DNA seguindo-se a adição de dois dímeros de histonas H2A-H2B para formar a partícula “core”.

As histonas sintetizadas de novo são especificamente modificadas por ex: a H4 é acetilada nas lisinas 5 e 12.

Durante a maturação subsequente é necessário ATP para estabelecer o espaçamento regular entre os nucleossomas e as histonas são desacetiladas.

A incorporação das histonas linker ( H1 ou outra) é acompanhada pela dobragem do filamento DNA ( que adquire estrutura solenóide com 6 nucleossomas por espira ou volta) produzindo as dobragens subsequentes uma organização definida.

As modificações nas histonas assinalam a progressão de estados cromatínicos definidos, assim o ciclo acetilação/desacetilação das H3-H4 durante a fase S do ciclo celular ou a fosfatação da H3/CENP-A na fase G2/M.

A incorporação de variantes das histonas como as H2A-X fosfatada encontra-se nas regiões com as duas hélices de DNA cindidas por radiações ionizantes, enquanto a variante CENP-1 da H3 está associada com regiões de heterocromatina silenciadas.

Na maturação a incorporação diferenciada de histonas linker e proteínas não histonas como as proteínas HMG e outros factores que se ligam ao DNA ajudam a espaçar e a dobrar o conjunto nucleossomal.



A fosfatação da H3 parece implicada na condensação e segregação dos cromossomas e a metilação da H3 na lisina 9 corresponde ao silenciamento.

Chaperones reguladores da cromatina podem imprimir especificidade à organização da cromatina bem como as “maquinas” remodeladoras, enzimas modificadores de histonas



Nas primeiras etapas da montagem  da cromatina a particula elementar pode assumir variações ao nível do DNA (por ex: metilação) ou das histonas por modificação covalente destas ou por incorporação de formas variantes (por ex: CENP-A. uma variante da H3) tudo isto introduzindo diferenças na estrutura e actividade da cromatina, ( Ridgway, et at,.2002).

1.4-Variantes da histona H3 especificam os modos de assemblagem da cromatina ( Ridgway e Almdzuni.,2001; Ahmad e Henikoff,2002)

A deposição de histonas é um fenómeno que decorre essencialmente quando o DNA se replica e para completar a duplicação da cromatina. ( Ahmad e Henikoff, 2002).

A deposição das H3 encontra-se restringida ao momento da replicação do DNA (RC no quadro adiante) com a consequente deposição das histonas. Mas a deposição da variante H3.3 já ocorre através do ciclo celular e sem que ocorra a replicação do DNA, o que confirma que esta deposição é independente da replicação (RI no quadro adiante).



Durante a fase S do ciclo celular as histonas são produzidas em grande quantidade ,por dezenas ou centenas de genes com a caracteristica curiosa de não possuírem intrões.  Algumas histonas são produzidas fora desta fase S por genes órfãos que codificam variantes das H3, como é o caso das H3.3. Os genes órfãos são regiões codificadoras de proteínas que não têm nenhum homólogo reconhecido em espécies afastadas (distantly related species), constituindo esses genes órfãos uma substancial fração das regiões codificadoras em qualquer genoma sequenciado (Domazet-Lose e Tautz, D.,2003).

A H3.3 é muito semelhante á H3 apenas diferindo nas posições de quatro ácidos aminados.

As H3 e H3.3 são depositadas quando o DNA se replica, mas a H3.3 também se pode depositar em locais em que não ocorre replicação do DNA (ver figura ).

Só numa pequena parte do genoma global se encontram nucleossomas com H 3.3 assemblada e em genes activos para transcrição.

A cromatina aberta nos centrómeros e nos genes activos podem promover a substituição de histonas.

Nas células em proliferação durante a replicação do DNA ocorre a manutenção da estrutura da cromatina de duas reações distintas que ocorrem rapidamente durante a passagem da forquilha de replicação do DNA ( Verreault. 2000).Primeiro, à medida que ocorre a segregação parental dos nucleossomas, ocorre a transferencia das histonas core pré-existentes para os dois cromatídeos nascentes, á frente da forquilha ( Krude 1995 citado em Verreault,2000), enquanto a outra metade do conjunto de nucleossomas é feita a partir de novas histonas recem sintetizadas, constituindo o que se designa por montagem de novo dos nucleossomas.

Esta organização de novo de nucleossomas implica que as histonas H3 e H4 sejam acetiladas e depositadas em primeiro lugar seguindo-se a junção rapidamente dos dímeros H2A/H2B que completam o “core” do nucleossoma.

Portanto pouco após a sua síntese as H3 e H4 associadas uma com a outra são acetiladas numa serie de lisinas nos seus domínios N-terminais. Esta acetilação é transitória e rapidamente removida após a sua assemblagem na cromatina.

Esta acetilação pré-assemblagem é catalizada por HAT do tipo B, que são enzimas distintas das HAT do tipo A que acetilam as histonas cromossomais (portanto pos-assemblagem).

No caso da forquilha de replicação as novas histonas são levadas para a forquilha atraves de um complexo com o factor 1 de assemblagem á cromatina (CAF1) associado com PCNA ( ring-shaped prolifering cell nuclear antigen) (vide figura 10 seguinte )



Portanto as histonas do DNA parental são distributivamente segregadas pelos dois cromatídeos irmãos á frente da forquilha de replicação e os espaços vazios no conjunto nucleossomal são rapidamente preechidos pelos nucleossomas biossintetizados e organizados de novo.. Estes nucleossomas são depois amadurecidos pela adição de histonas linker e por modificações covalentes das histonas.

Nucleossomas contendo variantes da H3 como pode ser o caso da H3.3 são em pequena proporção no conjunto da cromatina, mas em células que não se encontram em replicação a sua proporção pode ser muito enriquecida.

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A organização dos nucleossomas acoplados com a replicação necessitam de factores acessórios recrutados pela forquilha de replicação ( vide figura seguinte) enquanto este assemble independente da replicação com a deposição de H3.3 não requer porções das histonas que são necessárias para a deposição RC.

A deposição de histonas ao longo de todo o ciclo celular independentemente da replicação indica que os nucleossomas existentes e preformados devem ser desacoplados e as suas histonas libertadas, Factores remodeladores da cromatina que desestabilizam os nucleossomas têm sido identificados nos genes activos e nos centromeros e a sua actividade promoverá a substituição de histonas.

O estado heterocromatínico é especifico de uma modificação por metilação, irreversível. Contudo, um local heterocromático pode ser modificado para um estado activo.. Uma via para isto pode ser a de evitar a metilação dos nucleossomas durante a replicação, sendo os sucessivos ciclos celulares meio para diluir os nucleossomas metilados, até á sua eventual activação. Contudo pode haver outros meios para esta activação sem ocorrer divisão celular podendo o H3K9 ser removido sem assemblagem de nucleossomas acoplados á replicação. ( Ahmad e Henikoff citados em Ahmad e Henikoff.2002).

Pelo contrario um gene activo pode ser silenciado metilando a cauda da H3.3 na lisina 9.

Na figura seguinte 11 refere-se como a deposição de variantes H3.3 fora da replicação celular permite a modificação de estados cromatinicos hereditaveis,               



Legenda: Os nucleossomas na heterocromatina silenciada são modificados por metilação:  recrutando a enzima HMT Suvar 3.9 ( esta enzima pertence á família das HMTs lisinas com um dominio SET) e metila a K9 da H3 e pode ser recrutada por correpressores).

Esta marca silenciadora pode ser perpetuada pela Suvar 3.9 atraves do ciclo celular ao metilar a H3 após a deposição acoplada com a replicação ( linha verde? ).

No entanto um gene pode ser activado em qualquer altura do ciclo celular desenrolando-se dos nucleossomas metilados e depositando H3.3( linha vermelha   ) fora portanto da replicação celular, removendo assim a marca de silenciamento. Esta situação vai abolir o recrutamento do Suvar 3.9 e permitir a activação estável ( circulo vermelho ).            .

A deposição da H3.3 fora portanto da replicação continuará enquanto o gene for transcrito.

Na conversão de um gene activo para um gene silenciado (linha lilaz), a transcrição é reprimida por metilação da cauda N-terminal da H3.3 na lisina 9 uma vez mais com recrutamento do complexo enzimático Suvar 3.9.

As variantes da histona H3 são pois utilizadas para ordenar regiões da cromatina para funções especializadas, localizando-se essas variantes das histonas nos centrómeros e nas regiões com transcrição activa utilizando processos fora da etapa da replicação, num processo diferente daquele que ocorre durante a replicação e que leva á montagem da maioria do genoma.

A H3.3 que se encontra altamenete conservada dos moluscos aos mamíferos tem pois um papel fundamental nos núcleos eucariotas.

Enquanto a H3 é incorporada apenas durante a replicação do DNA, a H3.3 pode ser depositada sem ser durante a replicação ( Ahmad e Henikoff,2002).

A incorporação da H3.3 proporciona um mecanismo para a activação imediata dos genes que tenham sido silenciados pela modificação de histonas e a hereditariedade destes nucleossomas depositados de novo podem constituir marcas de loci activos (Ahmade Henikoff, 2002).                                                                                                                                                                                                            





 

2-Algumas caracteristicas ao nível do DNA   

2.1-Algumas características dinâmicas do DNA e a  transcrição

Recorda-se que a  dupla hélice de DNA existe com várias geometrias designadas como DNA A, B e Z. A assumpção destas diferentes conformações depende da composição em bases ( sequência de cada porção) do DNA e das condições físicas em que  estas se encontram. No entanto qualquer que seja a a conformação os fosfatos encontram-se sempre orientados na parte de fora das hélices e plenamente ionizados a pH neutro, do que resulta que essa parte de fora da hélice se encontra carregada negativamente.

As bases por outro lado situam-se no interior da hélice com as suas faces protegidas do contacto com a água.

As duas hélices enrolando-se uma na outra produzem uma estrutura que tem nas formas A e B duas depressões ou sulcos (“grooves”) helicoidais que separam o esqueleto enrolado formado pelos fosfatos sucessivos…………….

A geometria precisa da hélice dupla de DNA varia no entanto consoante as diversas formas. Assim no DNA B, que parece ser  a forma mais frequente “in vivo”, nas duas depressões (grooves) antes recordadas, uma depressão é mais larga (major Groove) que a outra ( minor Groove) o que parece resultar da geometria dos pares de bases que se situam nessas regiões.

Ocorre ainda que  os “ major grooves” e “ minor groove” nas moléculas de DNA ,são atapetadas por sequências especificas de grupos potenciais formadores de pontes de hidrogénio (portanto átomos dadores e receptores para pontes de hidrogénio) capazes de interactuar com moléculas proteicas adequadas. No “minor groove” encontram-se sobretudo neste contexto AT.

As formas de DNa A e Z diferem da do DNA B no grau de inclinação das suas bases em relação ao eixo da hélice e ainda diferem noutros parametros geometricos  (vide figura e quadro seguinte). Está demonstrado “ in vivo” a existência de conformações do DNA não na forma  B e o potencial envolvimento destas estruturas modificadas na regulação dos processos celulares( Goobes e Minsky, 2001).

As variações locais na conformação de cada nucleótido são pois muito importantes na regulação da expressão dos genes pois influenciam a extensão com que o DNA interactua com diversos tipo de de proteínas reguladoras

Outra forma de DNA a forma Z apresenta um arranjo em zig-zag do esqueleto fosfodíester polinucleótido, sendo sendo mais comprido e muito mais estreito que o DNA B, formando uma única depressão  (Groove) ao contrário das duas observadas no DNA B.

Estas formas DNA Z (em que alternam as purinas com as pirimidinas), encontram-se mais frequentemente nas extremidades 5’ dos genes, ou seja em regiões que regulam a transcrição, parecendo intervir também em regiões de recombinação genética nas células eucariotas.

Pequenas porções do DNA com cerca de 12-24 bp de comprimento com potencial para formar Z tem sido encontradas nas extremidades  5´dos genes.

Também os locais de recombinação genética nas células eucariotas parecem estar associados com as formas Z do DNA.

Também sequências  do DNA em que não se observa alternância purinas-pirimidinas, em consequência de metilações, podem adquirir a forma Z.

Admite-se que a metilação da citosina induza formas B do DNA para formas Z do DNA:, o que sugere que o  Z-DNA tem um papel regulador dos genes.

Existem algoritmos para predizer da propensão de uma determinada sequência de DNA de passar da forma B para a forma A ( A-DNA Wikipedia, the free encyclopedy).

A forma B do DNA é mais frequentemente encontrada em solução e “in vivo” .No entanto em condições de baixa concentração de sais e humidade, a forma de B-DNA  pode deslocar-se para a conformação A-DNA (com maior diâmetro que a B e com uma major Groove mais estreita e profunda e uma minor Groove mais larga e rasa que a forma B.)

A forma A do DNA tende a surgir em porções do DNA com longas sequências de purinas assim como no RNA de cadeia dupla, e nos híbridos RNA/DNA.

A forma Z do DNA é muito mais rara que a forma A e sobretudo que a forma B.

  

Salienta-se que para o mesmo numero de pares de bases o comprimento de A é menor que o de B e este menor que o de Z, sucedendo o inverso com a largura ou diâmetro da dupla hélice em que A> B > Z.



 * Há autores como por ex: Devlin e outro que referem que as formas Z do DNA formam uma única “Groove”  a minor ( ao contrario das formas B) em virtude de ocorrer como que uma expansão da porção correspondente á  major Groove do B-DNA e que formaria uma superfície convexa um tanto achatada no exterior desta região do DNA. Tudo isto devido a sequência repetida dCGCGCG  característica da forma Z.                                                           

A molécula de DNA é pois uma estrutura dinâmica que pode assumir uma diversidade de formas.

Isto deriva de cada cadeia de DNA poder rodar em torno de seis ligações químicas covalentes de cada nucleotido (na ligação glicosídica entre a base púrica ou pirimídica e o açúcar-pentose- na ligação C4’-C5´da pentose,e nas quatro ligações da ponte fosfodíester que liga o C 3’ de uma pentose com o C 5’ da pentose do nucleótido seguinte.) Se compararmos isto com o que sucede nas cadeias polipeptídicas em que há apenas duas hipóteses, vemos  o grande dinamismo que pode animar a estrutura do DNA).

Por outro lado ao longo da molécula de DNA podem ocorrer variações locais na conformação da dupla hélice em função da sequência de bases contidas nesses mesmos locais. Uma proteína que procure uma sequência especifica do DNA com a qual possa interactuar tem pois que rastrear a presença dessa sequência que se encontrará com um formato preciso na dupla hélice que lhe corresponde.

A hélice de DNA-B pode também arquear.se ou superenrolar-se o que lhe permitirá “enrolar-se” á volta de proteínas.

O DNA pode arquear-se em determinados locais da sua molécula em virtude de sequências específicas das bases aí residentes, como é o caso da existência de tractos de pelo menos quatro adeninas, ou por interação com uma proteína.

Quanto às estruturas secundárias e terciárias que podem surgir nas moléculas de DNA, além das formas A, B e Z, com predominância das formas B podem ainda ocorrer conformações tridimensionais, cruciformes e em ganchos de cabelo, triplex e quadruplex (G4), por exemplo nos telómeros e noutros locais.

Conformações alternativas do DNA (Devlin. fourth edition).

As variações na conformação do DNA ( A, B e Z –DNA) estão sobretudo associadas com a variação na conformação dos constituintes nucleotídicos do DNA. O DNA não é uma estrutura direita estável, monótona e uniforme formando sim estruturas até um tanto invulgares como no caso dos arranjos cruciformes ou em hélice tripla e até com arqueamentos ou inclinações (bends) quando interactua com certas proteínas.

Estas variações na conformação do DNA são favorecidas por motivos específicos existentes na sua sequência, ou sejam elementos de DNA, como por exemplo as repetições invertidas, as repetições ao espelho ou repetições directas, as sequências homopurinas- homopirimidinas, tractos em fase A e ou regiões ricas em G.

Como já referimos as sequências de DNA que possuem 4 a 6 adeninas intervaladas por espaçadores de 10 bp produzem conformações encurvadas ou dobradas (bending). Estas dobras ou curvaturas são um elemento fundamental para a interação entre as sequências de DNA e proteínas implicadas na transcrição, recombinação e recombinação específica no local. As interações do DNA com as histonas induzidas por estas dobras do DNA consequentes ao tracto A não necessitam no entanto uma sequência nucleotidica  exacta..

Há portanto um efeito de dobragem na molécula de DNA gerado pelo tracto A. Contudo vários tractos A sem espaçadores entre si podem gerar DNA anisomórfico que é menos flexível que o habitual.Com efeito os tractos A (sucessivas adeninas) são caracterizadas por uma rigidez invulgar ,portanto inflexibilidade e têm um comportamento que opõe a mudanças da conformação dessa região (Park e tal., citados em Goobes e Minsky,2001).

No entanto estes tractos A podem ser estruturalmente perturbados por sequencias nucleotídicas vizinhas afectando portanto a sua propensão para interactuar com outras moléculas, tudo dependendo do equilíbrio que se possa vir a estabelecer entre umas e outras sequências nucleotídicas..

O DNA é enrolado á volta do octamero de histonas como uma superhelice negativa toroidal. As histonas contactam com a “minor Groove” do DNa e deixam a “major Groove”deste livre para interactuar com proteínas que regulam a expressão dos genes e para outras funções do DNA:

Os nucleossomas costumam-se referir como integrando duas estruturas distintas, o nucleossoma “core” e o cromatossoma.Recorda-se o nucleossoma consiste de cerca de 146 bp de DNA enrolado 1/3/4 de volta superhelicoidal à volta do octâmero de histonas, enquanto o cromatossoma consiste de cerca de 166 bp de DNA (duas voltas superhelicoidais), sendo a histona H1 retida por esta partícula. Cromatossomas contendo menos de 166 bp não ligam a subunidade H1.

Os cromatossomas são pois nucleossomas contendo uma molécula da histona H1.

Os polinucleossomas consistem de numerosos nucleossomas ligados através do DNA linker cujo tamanho varia consoante o tipo de células,

O  posicionamento dos nucleossomas ao longo do DNA parece depender da sequência deste.O DNA dobra-se (bend) mais notoriamente à volta dos octameros de histonas.

Durante a mitose a compactação do DNA aumenta até cerca de 10.000 vezes o que é acompanhado por um aumento torsional na sua estrutura tal como aumenta em cerca de 10 vezes as propriedades da cromatina que passa a comportar-se como se se tratasse de uma única cadeia descompactada.

2.2-Aspectos básicos comuns da regulação da actividade dos genes nos eucariotas( Gene regulation in eukariotes)

Não desenvolvemos a matéria relacionada com a regulação de genes não codificadores de proteínas e dos seus transcritos (nc RNA) podendo ser consultados sobre esse assunto os trabalhos de Dias Correia, J. H. R, e Dias Correia, A. A. referidos na bibliografia final.

Como é já conhecido os genes eucariotas codificadores de proteínas possuem na sua estrutura diversas características tais como: (vide figuras 13  e 14 seguintes)



1-Exões cujas sequências globais codificam o polipéptido.

2-Intrões que são removidos do RNA mensageiro (m RNA) transcrito antes deste ser traduzido ou expresso em polipéptido.

3- Um local de inicio ou partida para a transcrição.

4-Um promotor;

          -O promotor “core”ou basal situado dentro de cerca de 40 bp do local de início da transcrição.

           -Um promotor acima (upstream) que se pode estender a mais de 200 bp de distância

5-“Enhancers”

6- Silenciadores

7- Genes adjacentes (codificadores de RNA ou codificadores de proteínas) são por vezes separados por um isolador (insulator) que ajuda a evitar cruzamentos entre os promotores.

O local de partida para a transcrição é o local onde uma molécula da enzima RNA  polimerase ll ( pol ll ou RNA P ll) se liga. Esta pol ll é um complexo de 12 proteínas diferentes (bola amarela..na figura13).

O promotor basal contem uma sequência de 7 bases (TATAAAA) chamada caixa TATA que se liga a um grande complexo com cerca de 50 proteínas diferentes incluindo:

a) O factor de transcrição llD ( TF llD) ( Bola azul na figura pagina 13) que é um complexo com a seguinte composição: 

       -Uma proteína TBP que liga à caixa TATA
      -14 outras proteínas que se ligam à TBP e umas com as outras mas não com o DNA

b) O factor de transcrição ll B ( TF ll B) que se liga ao DNA e á pol ll.

Este promotor basal ou “core” encontra-se em todos os genes que codificam proteínas, ao contrário do promotor acima ( upstream) cuja estrutura e factores de interacção que eles interactuam varia de gene para gene.

Diversos tipos de células que integram os animais superiores, bem como diferentes tipos de genes que nelas se encontram podem utilizar os mesmos factores de transcrição para interactuarem com o promotor basal ou com outros locais acima deste, simplesmente em cada tipo de célula ou em cada tipo de gene hà provavelmente uma combinação única dos locais promotores e dos factores de transcrição que com eles podem interactuar o que lhes dá uma identidade própria.

Os genes para RNA não codificadores de proteínas ( nc RNA) ao contrário dos genes mRNA mensageiros ou codificadores de proteínas, não têm sinais fortes para transcrição (Thomassen, G.,2004) e nos genes codificadores de proteínas sabe-se que há uns com promotores fortes ( intensamente transcritos) ao contrário de outros.

Os “enhancers” ou facilitadores são factores de transcrição que interactuam com regiões do DNA situadas a milhares de pares de bases de distância do gene que controlam podendo situar-se acima, abaixo ou no interior desse gene que controlam, sendo possível que a as proteínas de ligação ao enhancer interactuam com os factores de transcrição (TF) organizados no promotor do gene ( Como se esquematiza na figura 14 seguinte) promovendo a forrmação de uma ansa no DNA.



Os silenciadores, que controlam certas regiões do DNA podem também ser localizados a milhares de pares  de bases de distancia do gene que controlam, contudo quando interactuam com factores de transcrição reprimem a transcrição do gene que controlam.

Para evitar que um enhancer situado a milhares de pares de bases de distância do gene regulado, possa inadequadamenete interactuar e activar o promotor de qualquer outro gene na mesma região do cromosssoma, existem isoladores. Estes isoladores são traços de DNA ( de alguns pares de bases como por ex:42), localizados entre o “ enhancer” e o promotor ou entre o silenciador  e o promotor de genes adjacentes ou de “ clusteres” de genes adjacentes, que  evitam que um gene seja influenciado pela activação ou repressão dos genes vizinhos (Vide figura  15 seguinte ). 



O isolador entre o promotor do gene A e  o promotor do gene B impede que a activação de um se extenda ao outro.

Todos os isoladores conhecidos nos vertebrados funcionam apenas quando ligados a uma proteína CTCF(CCCTC Binding factor), assim designada devido à  sequencia nucleotidica CCCTC encontrada em todos os  isoladores, e  essa proteína posui na sua estrutura 11 dominios “ zinc finger”.

Também no caso do imprinting do gene  IGF2 ( Insulin-like growth factor-2) nos ratos, suínos e seres  humanos ,intervem um isolador ente  o promotor IGF2 e  o enhancer no alelo materno que inactiva a transcrição enquanto no alelo paterno este isolador está metilado impedindo a ligação do CTCF e consequentemenete há transcrição nesse alelo que se encontra activo.

Como já referimos há vários tipos de factores de transcrição. Assim há que considerar o de transcrição basal que é requerido pela RNA polimerase II para formar ao nível de todos os promotores, o complexo de iniciação.

Outro tipo destes factores são os activadores que activam a expressão do gene interactuando ao nível do promotor com elementos de resposta que são portanto uma sequência no promotor reconhecida por um factor de transcrição específico.

Os coactivadores são necessários para  a transcrião mas não se ligam ao DNA, interactuando com activadores esses sim ligando ao DNA, e  interactuando com os factores de transcrição basal.

Há vários elementos de resposta identificados como por exemplo os HSE (heat schock response element) , o GRE ( glucocorticoidd response element, ) o SER ( serum response element) , etc.

Nas estruturas das  proteínas factores de  transcrição há diversos tipos de domínios identificados que têm capacidade para se ligar ao DNA tais como:


  • Zinc finger
  • Steroid receptor
  • Helix-turn- helix
  • Homeodominio
  • Helix-loop- helix (HLH)
  • Leucine zipper 
-Classificação de factores de transcrição em função das suas características estruturais ( Adaptado de  DNA –binding proteins)
Nas bases de dados disponíveis há 2.785 entradas par factores de transcrição, embora vários deles sejam proteínas homólogas de diferentes espécies.



   

 

Transcrição e RNA polimerases, factores gerais de transcrição, “enhancers” e activadores

Como é sabido a transcrição é iniciada em locais promotores no DNA molde.

Os promotores diferem consideravelmente na sua eficácia, pois enquanto os promotores fortes originam frequentes iniciações da transcrição, promotores fracos são transcritos muito mais vagarosamente.

Recorda-se ainda que a frequência da transcrição de muitos genes é poderosamente influenciada pelas proteínas reguladoras que se podem ligar a sequências específicas próximas do local promotor e interactuar com a RNA polimerase.

Também é sabido que a RNA polimerase desenrola cerca de duas voltas do DNA molde ( um segmento de 17 bp o que corresponde a 1,6 voltas da hélice de B-DNA) antes de iniciar a síntese do RNA.

Por outro lado, recorda-se também que o alongamento da síntese do RNA ocorre em “bolhas” de transcrição que se movem ao longo do DNA molde em conjunto com o complexo RNA polimerase. A bolha de transcrição contem uma região localizada do DNA cujas hélices se afastam permitindo a formação de uma hélice híbrida de DNA-RNA sintetizada de novo de cerca de 12 bp de comprimento que corresponde a cerca de uma volta de uma hélice do tipo A-DNA.

RNA polimerases  (Regulation of transcription)

Recorda-se que as RNA polimerases dos eucariotas envolvem três tipos diferentes de RNA polimerases que dão origem a:

              
RNA polimerase I   -.----45 S pré- ribossomal RNA
RNA polimerase II-------pré-m RNAs e algum sn RNA
RNA polimerase III-----pré- t RNA ; 5s ribossomal RNA, algum sn RNA
 
Cada tipo de polimerase produz tipos específicos de produtos RNA e operam independentemente com promotores únicos e elementos de controlo.
A RNA polimerase II é a que tem maior número de alvos e mecanismos de controlo, possui cerca de 514 KDa, é constituída por 12 subunidades proteicas codificadas pelos genes RPB 1 até 12 ( Cramer e tal .2000 citados em Regulation of transcription). A maior destas subunidades a RPB 1 (196 KDa) tem um domínio C-terminal por vezes designado RNA polimerase II CTD que consiste de uma série de heptades repetidas- YSPTSPS-, contendo múltiplos locais para fosfatação sendo esta fosfatação do CTD indispensável para as transcrições sucessivas no alongamento do RNA.

Estas subunidades envolvidas na activação, e seleção do ponto de partida, catalise, resposta ao stress, montagem da polimerase, alongamento, adaptadores, etc a maioria destas subunidades da RNA polimerase II ligam zinco formando “dedos de zinco” que se organizam em locais de adaptação para interação com diversas outras proteínas.

Factores gerais de transcrição

Como já referimos são proteínas acessórias não específicas de cada gene e que facilitam a transcrição, aquelas que acompanham as polimerase II são chamadas TF II, e incluem a TF IID e diversos outros factores actuam em conjunto com a polimerase II formando a holoenzima.
Três componentes são necessários para iniciar a transcrição nos eucariotas;

 

  1. diversas proteínas activadoras específicas de vários locais que se ligam a elementos “enhancer” do DNA
  2. o complexo de reconhecimento TF IID comum dos promotores
  3. a holoenzima RNA polimerase II que se liga à região iniciadora no DNA (INR na figura 16 seguinte  .Este INR consiste de uma serie de pirimidinas imediatamente acima do nucleotido _+ 1 ( ponto de partida da transcrição+)
 

 

O complexo TF IID consiste de uma proteína TBP que se liga á caixa TATA e de diversos factores associados ao TBP ou sejam os TAF II.

Parecem existir três grupos funcionais de TAFS no TF IID. ( ver na figura 17 seguinte ) (Naar e tal ,2001 citados em Regulation of transcription).

 

O grupo 150, 130, 55, 28, e 18 estão estreitamente associados com o TBP e dentro deste grupo o hTAF 130 e h TAF 55 interactuam com activadores acima,e o hTAF 150 pode interactuar com INR.

O hTAF 250 interactua com nucleossomas actuando como enzima HAT

O último grupo com as h TAF 100, 70, 31, 30, 20, são associados com o TAF 150 e estabelecem contacto com locais promotores abaixo.

Existem outras classe de factores gerais da transcrição tais como os TF IIA, B, E, F, H, e S, com características um tanto diversificadas e complexas.

A organização do TBP, TF II B, TF IIF, TF IIE, TF II H e RNA polimerase II constitui o complexo mínimo de préiniciação ou PIC.



A TF II E liga-se à RNA polimerase II com a porção CTD C-terminal desfosfatada, esta TF II E recruta a TF II H para o PIC a TF IIH através da sua subunidade CDK 7 fosfata a CTD, estabelecendo-se assim um ciclo de fosfatação e desfosfatação que controla as transições do início da transcrição para o alongamento do transcrito.

Após a iniciação o TBP permanece na caixa TATA, o TF IIB dissocia-se após se formarem a primeira ou as 2 ligações fosfodíester entre os nucleótidos do RNA, e a TF II E após se formarem 10 ligações fosfodíester e a TF IIH após cerca de trinta ligações.

Enhancers e activadores

A activação é uma exigência absoluta para a transcrição a partir de moldes da cromatina.

A presença de nucleossomas impede ou melhor excluem os volumosos complexos TF II D e RNA polimerases II de acederem ao DNA, mas proteínas activadoras da transcrição com capacidade de ligação a simples e limitadas porções de DNA são capazes de se introduzir dentro do DNA nucleosomal induzindo uma abertura da cromatina e a acoplagem da “maquinaria” da transcrição.

Estes activadores proteicos da transcrição `têm um dominio simples para se ligarem ao DNA numa sequência alvo, o enhancer, e um domínio para activação.

O reconhecimento do enhancer envolve habitualmente a inserção de hélices sonda do activador na “major Groove” do DNA, onde os ácidos aminados dessas hélices do activador formam pontes o hidrogénio com os grupos adequados dos pares de bases contidos no DNA dessa zona.

As hélices sonda dos activadores têm estruturas típicas dos tipo leucina zippers (b-zips)(b-para básico) hélice-loop-hélice (hhlh), homeodomínios (hox) ou hélice-turn- hélice e dedos de zinco (zinc finger), tendo estes domínios abundantes argininas e lisinas carregadas positivamente, a interactuar com os grupos negativos nos fosfatos do DNA.

Uma simples hélice contacta com 3 a 4 pares de bases do DNA e para se formarem enhancers com um local  para reconhecimento, extenso, estes domínios proteicos que se ligam ao DNA podem dimerizar-se ou heterodimerizar-se ou arranjarem.-se em tandem numa simples cadeia.

O resto da estrutura da proteína activadora corresponde a diversas zonas para interação com diversas proteínas.

O domínio para activação que existe na estrutura dos activadores pode  interactuar directamente com componentes do TF II D ou com a holoenzima polimerase II, ou pode interactuar com diversos coactivadores ou correpressores, ou até com receptores de sinais externos.

Na estrutura destas proteínas activadoras o domínio de activação são polipéptidos não estruturados (adaptando-se portanto facilmente aos seus alvos) ricos em ácidos aminados acídicos, podendo nos eucariotas superiores encontrar-se destes domínios ricos em glutamina..

Os factores proteicos coactivadores, não têm local na sua estrutura para interactuar com o DNA, mas interactuam sim com factores de transcrição que se ligam ao DNA.Desencadeiam pois interações de proteínas com proteínas. Os factores correpressores também não possuem locais na sua estrutura para interactuar com o DNA mas exercem um efeito regulador  negativo quer escondendo locais de activação ou exercendo efeitos alostéricos sobre outras proteínas.

Referem-se seguidamente alguns activadores bem conhecidos:

  • Sp 1  -Proteína de especificidade1
  • STAT-Transductor de sinal e activador da transcrição
  • NF-KB-Factor nuclear KB
  • AhR-Receptor aryl-hydrocarbon
  • SREBP-Proteína de ligação a elemento receptor de sterol
A designação de enhanceossoma aplica-se a um grupo de factores de activação, que se ligam em combinações permitindo diversos sinais e respostas transcricionais.

A interação dos coactivadores com a polimerase II depende de um componente da holoenzima chamada mediador. O mediador liga-se com a forma não fosfatada da pol.II CTD e estimula a sua fosfatação pela TF IIH como já referimos. O repressor Med.N contem a cinase CDK8 (SRB10) que inactiva a cinase CDK7 componente da TF IIH.

3-Possiveis implicações da dinâmica da cromatina sobre o epigenoma

Segundo a definição clássica de Ptashne e Gann (2002) por epigenética entende-se uma mudança no estado de expressão de um gene que não envolve uma mutação, mas que é contudo herdada ( após a divisão celular) na ausência de um sinal ( ou acontecimento) que desencadeie essa mudança.

Sabe-se hoje que o funcionamento dos genomas, tal como a ultraestrutura da cromatina podem ser modelados pelas modificações químicas do DNA ou das próprias histonas que integram essa cromatina.

O epigenoma corresponderá a todas estas modificações bioquímicas que sem serem mutações são potencialmente hereditárias , e que definem cada tipo de célula e os seus conjuntos de genes activos e inactivos.

Cada célula terá uma composição do seu epigenoma condicionada por determinanates genéticas, linhas celulares e ambiente em que se encontra inserida ( Bernstein e tal, 2007; Brero e tal. ,2006).

Em cada um dos animais superiores a maioria das células que constituem cada um deles possuem uma informação genética idêntica mas diferem essas células umas das outras na sua informação epigenética que surge ( após a replicação do DNA) por metilação de certas bases desse DNA ( por: ex. nos mamíferos na 5-metilcitosina nas “ilhotas” CpG ) e através de diversas modificações nas histonas da cromatina e ainda pelo jogo do RNA i.

No entanto uma vez estabelecido numa célula o seu epigenoma é contudo necessário duplicá-lo em cada divisão celular que se opere quer ao nível da informação genética contida no próprio DNA quer ao nível da informação epigenética. Justifica-se pois que seja  feita uma actualização de conhecimentos neste âmbito procurando numa 1ª fase rever aspectos estruturais e funcionais fundamentais dos núcleos celulares e de algumas moléculas e ultraestruturas intervenientes,e numa 2ª parte revendo algumas formas epigenéticas que podem condicionar toda a vida das células, quer por complexos que modificam as histonas, quer por complexos que remodelam a cromatina, inclusive a replicação, transcrição e reparação do seu DNA...

Como facilmente se deduz estas matérias irão ter um desenvolvimento futuro exponencial o que nos leva a considerar ser pertinente a sua introdução, revisão e actualização tal como em parte já desenvolvemos num outro texto  publicado online e que designámos “Epigenética nos Animais”.editado pela Ordem dos Medicos Veterinários em Portugal

Bibliografia  

  • A-DNA Wikipedia
  • Ahmad, K. e Henikoff, S.. Histone H3 variants specify modes of chromatin assembly. PNAS, 2002, 99 (4):16477-16484-
  • Ahmad,K. E Henikoff,S..The histone variant H3.3 marks active chromatin by replication-indepemdent nucleosome assembly.Molecular Cell,2002,9,1191-1200.
  • Baxevanis, A. D. et. Al. A variety of DNA-binding multimeric proteins contain the histones fold motif. Nuceic Acid Research, 1995, 23 (14): 2685-2691.
  • Bernstein, B. E. et al. The mammalian epigenome, Cell,2007, 128 (4): 669-81.
  • Brero, A. et al. Replication and translation of epigenetic information. Curr Top Microbiol. Immunol.,2006,  301:21-44-
  • Colvis,C.M. et al. Epigeneticmechanisms and genes networks in nervous system..The Journal of Neuroscience,2005.25(45):10379-10389
  • Cornforth, M. N., ET al.. Chromosomes are predominantly located randomly with respect to each other in interphase human cells.The Journal of Cell Biolgy, 2002, 159 (2).237-244.
  • Correia, J. H. R. D. e Correia ; A. A.  D.-Funcionalidades dos RNA não codificantes (ncRNA) e pequenos RNA reguladores , nos mamíferos,REDVET ,2007 VIII (10) :1695-7504
  • Correia, J. H. R: Dias e Correia, A. A: D. Introdução à biotecnologia Animal Moderna. Elementos de Biologia Molecular Animal.. Ordem dos Medicos Veterinários , 2007
  • Devlin.  T..Textbook of Biochemistry with clinical correlations. Fourth Edition
  • Domazet-Lose, T. e TTautz, D,. An  evolutionary analysis of orphan genes in Drosophila, Genome Research, 2003, 13: 2213-22191.
  • Ehrenhofer-Murray, A. E. .Chromatin dynamics at DNA replication transcription and repair. Eur. J. Biochem.2004, 271: 2335-2349.
  • Goobes,R. e Minsky. Contextual equilibrium effects in DNA molecules, Journal of Biological C hemistry, 2001,  276 (19): 16155-16160
  • Haff, T. e Schmid, M. Chromosome topology in mammalian interphase nuclei.Exp. Cell Res.,1991, 192 (2):325-32
  • Jablonka, E.Epigenic Epidemiology.International Journal of Epidemiology,2004,33.929-931
  • Makaloowska, I. et al. Histone sequence database: sequences, structures, post-translational modifications and genetic loci.Nucleic Acid Research 1999,  27 (1): 323-324.
  • Nagele, R. G. e tal. Chromosomes exhibit preferential positioning in nuclei of quiescent human cells.Journal of cell Science, 1999, 112:525-535.
  • PIna, B. e Suau, P.. Changes in histones H2A and H3  varants in differentiating and mature rat brain cortical neurons.Dev Biol, 1987, 123 (1) :51-8
  • Regulation of transcription
  • Ridgway, P. et al .Functional organization of the genome chromatin.Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology. 2002,http://www.infobiogen.fr/sevices/chhhromcancer/Deep/chromatinDee..
  • Ridgway, P. e Almouzni, G. Chromatin assembly and organization, Journal of Cell Science,2001, 114:2711-2712.
  • Srinivas, Bharath,M. M: et al .Prediction of an HMG-box fold in the V-termonal domain of histone H1: insights into its role in DNA condensation. Proteins:Structure, Function and genetcs, 2002,49: 71-81.
  • Srinivas Bharath et. Al. Molecular modelling of the chromatosome particle. Nucleic Acds Research, 2003, 31 (14):4264-4274-
  • Thomassen. G.. Detection of non-coding RNA genes by searching for transcription signals in intergenic regions. 2004. University of oslo. Departement of onformatics,
  • Urban, M. K. e Zweidler, A. Changes in nucleosomes core histone varaiants during chicken development and maturation, Dev. Biol. 1983.  95(2): 421-428.
  • VanDriel, R. et al.. The eukaryotic genome: a system regulated at different hierarchical levels. Journal of Cell Science, 2003, 116:4067-4075.
  • Verrault, A. De novo nucleosome assembly: new pieces in an old puzzle, Genes & development, 2000,  14:1430-1438
  • Wade, P. A: e Kikyo, N.. Chromatin remodeling in nucler cloning. Eur. J. Biochem..2002, 269:2284-2287.
  • Wakter, J. et al..Chromossomse order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.Journal of Cell Biology, 2003, 160(5),685-697
  • Wolffe, A. P. .Transcriptional regulation in the context of chromatin      structure.Essays Biochem, 2001, 37:45-57.
  • Workman, J. L. e Abmayr, S. M. -1430 Histone H3 variants and modifications on transcribed gene. PNAS, 2004, 101 (6) :1429
  • Zhou, Y. B. et al ..Position and orientation of the globular domain of linker histone H5 on the nucleosome. Nature, 1998, 395:402-405.
 
 


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